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第三代測序技術
第三代測序技術是指單分子測序技術。DNA測序時,不需要經過PCR擴增,實現了對每一條DNA分子的單獨測序。
第三代測序技術原理主要分為兩大技術陣營:
第一大陣營是單分子熒光測序,代表性的技術為美國螺旋生物(Helicos)的SMS技術和美國太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技術。脫氧核苷酸用熒光標記,顯微鏡可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候,它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學鍵的時候,它的熒光基團就被DNA聚合酶切除,熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性,并且在熒光被切除之后,合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。
第二大陣營為納米孔測序,代表性的公司為英國牛津納米孔公司。新型納米孔測序法(nanopore sequencing)是采用電泳技術,借助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔 來實現測序的。由于納米孔的直徑非常細小,僅允許單個核酸聚合物通過,而ATCG單個堿基的帶電性質不一樣,通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別,從而實現測序。
1)測序文庫的構建(Library Construction)
首先準備基因組(雖然測序公司要求樣品量要達到200ng,但是Gnome Analyzer系統所需的樣品量可低至100ng,能應用在很多樣品有限的實驗中),然后將DNA隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段,并在兩頭加上特定的接頭(Adaptor)。如果是轉錄組測序,則文庫的構建要相對麻煩些,RNA片段化之后需反轉成cDNA,然后加上接頭,或者先將RNA反轉成cDNA,然后再片段化并加上接頭。片段的大小(Insert size)對于后面的數據分析有影響,可根據需要來選擇。對于基因組測序來說,通常會選擇幾種不同的insert size,以便在組裝(Assembly)的時候獲得更多的信息。
2)錨定橋接(Surface Attachment and Bridge Amplification)
Solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行,flow cell又被細分成8個Lane,每個Lane的內表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構,以供后續的預擴增使用。
3)預擴增(Denaturation and Complete Amplification)
添加未標記的dNTP 和普通Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增,單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性,釋放出互補的單鏈,錨定到附近的固相表面。通過不斷循環,將會在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。
4)單堿基延伸測序(Single Base Extension and Sequencing)
在測序的flow cell中加入四種熒光標記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增,在每一個測序簇延伸互補鏈時,每加入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應的熒光,測序儀通過捕獲熒光信號,并通過計算機軟件將光信號轉化為測序峰,從而獲得待測片段的序列信息。從熒光信號獲取待測片段的序列信息的過程叫做Base Calling,Illumina公司Base Calling所用的軟件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響,如熒光標記的不完全切割。隨著讀長的增加,錯誤率也會隨之上升。
5)數據分析(Data Analyzing)
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分,但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數據是長度只有幾十個堿基的序列,要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架,或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上,并進一步分析得到有生物學意義的結果。
 
 
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