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細胞培養知識

細胞培養知識

細胞培養知識(一)
1 冷凍管應如何解凍?
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO?
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基?
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基, 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類?
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源, 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統,而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基?
視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

8 培養基中是否須添加抗生素?
除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理? 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于-20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理?
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何?
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養基之成份為何?
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染?
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

18 如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?
直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?
不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株, 無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養有何影響?
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

21 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性?
培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。

24 各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?
不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

25 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤, 造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

細胞培養知識(二)
無菌操作基本技術
1. 實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol 之產生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目: 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。

實驗用品
1. 種類?
1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌,除了玻璃容器與pasteur pipet 外,其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附,培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml,均有2 種不同材質,其中polypropylene (PP) 為不透明材質,polystyrene (PS) 為透明材質,可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉廢棄培養液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時,洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶,以高壓蒸汽滅菌,洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈,勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋,高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘,置于oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養基
1. 液體培養基貯存于4℃冰箱,避免光照,實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。
2. 液體培養基(加血清) 存放期為六個月,期間glutamine 可能會分解,若細胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養基配制(以1 升為例):
3.1. 細胞培養基通常須添加10% 血清,因此粉末培養基之配制體積為900ml,pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加,若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差,或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合,然后用CO2 氣體調整pH,而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH),因為氯離子對細胞生長可能有影響,且貯存時培養基的pH 易發生改變。 3.2. 材料:
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水,水品質非常重要)
3.2.2. 粉末培養基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟:
3.3.1. 取粉末培養基溶于700ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數量依培養基種類而異,表一)溶于200ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2 氣體至飽和,約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合。混后溶液之pH應為7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否則不需用酸堿再調整之。若為太堿,可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時,pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,同時分裝至無菌容器中,標示培養基種類、日期、瓶號等,貯存于4℃。(血清亦可加入培養基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養基之生長測試
4.1. 材料:
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟:
4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell,接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每個well 接種1 × 102 活細胞,同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5~7 天后,在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長,待細胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸時即可。 4.2.3. 去除培養基,加入1ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸? 3:1),室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液,水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液,水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數群落數,并比較之,若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳,則丟棄之。

細胞培養知識(三)
如何選用特殊細胞系培養基?
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始,各種目的無血清培養最好首選AIM V(12005)培養基(SFM)。

L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?
GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

什么培養基中可以省去加酚紅?
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。如何用臺盼蘭計數活細胞? 用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200~2000個/毫升,在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。

如何消除組織培養的污染?
當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。 1. 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。 2. 分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。4. 確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。 5. 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 6. 重復步驟4。 7. 在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。

培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

細胞培養知識(四)
1.如何選用培養基?
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養,各種目的無血清培養的首選是AIM V培養基(SFM)。

2.為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。

3.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?
它在溶液中不穩定嗎? L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么?
培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定? GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

5.為什么培養基中可以省去加酚紅?
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

6.如何用臺盼蘭計數活細胞?
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升,在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養的污染?
當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2)分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2-3代。
5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6)重復步驟4。
7)在無抗生素的培養基中培養4-6代,確定污染是否以已被消除。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?
Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別? HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測:End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌體檢驗生物化學檢測 激素的檢測血紅蛋白檢測Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎?
是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中,稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后,在復合物中加入含有血清的培養基(800μl)。(注意以上是35mm培養皿使用體積)。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體,接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ時,細胞生長良好,但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好?
如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測內毒素(熱源)水平?
LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統(絲氨酸蛋白酶級聯反應系統),通過修飾凝集素,產生一種透明的膠,LAL中的凝固蛋白,從而,形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟(血細胞)裂解物。胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island,按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前,用無熱源的水1:10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘,以消除抑制劑。(通常,血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程,使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。)

15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎?
如果使用固體形式的培養基,需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌,應該高壓滅菌瓊脂溶液,然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

16. 20℃下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎?
對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時,PH值的變化情況例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)=6.7817. 室溫下(25℃)配制的

17.Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同的PH值。

18. 昆蟲細胞培養的最適PH值和滲透壓是多少?
生長培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系,在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時,培養基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式,減少技術問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

19. High Five細胞有任何其它名稱嗎?
High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少?
High Five無血清培養基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five細胞用多大的密度凍存?
3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎?
可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。

23.如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?
我們強力推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術破壞性最小,生活力最高。通過使用巴氏德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:1)去除培養基。2) 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。4) 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。5) 向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。)6) 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。7) 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少?為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 25.如何評估ES細胞合格的胎牛血清? 使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關生長效率分析:當ES細胞以非常低的密度傳入包含10%胎牛血清的生長培養基中,檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。細胞毒分析:當以非常低的密度傳入包含30%胎牛血清的生長培養基中,檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。相關形態學和分化分析:檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅,分化的細胞較大,豐滿,顏色較淺。所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的,培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。(ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。)經過培養發現,大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。

26.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎?
通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候記數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。

 

 
 
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